Сканирующий конфокальный лазерный микроскоп: как работает устройство

Большинство конфокальных микроскопов — это лазерные сканирующие микроскопы, принцип работы которых был разработан в 1955 году Марвином Мински. В них лазерный луч сканирует объект точка за точкой, максимально фокусируясь в фокальной плоскости образца, подлежащего микроскопированию.

При этом возбуждаются флуоресцентные молекулы, которые находятся на пути света сфокусированного лазерного луча. Если сигналы флуоресценции воспроизводятся на плоскости изображения, в которой присутствует небольшое отверстие, только сигналы, исходящие из фокальной плоскости, могут попадать точно в данное отверстие. Компоненты сигнала, которые исходят из других плоскостей — выше или ниже фокальной плоскости в образце, таким образом маскируются, и создается изображение среза.

За апертурой расположен светочувствительный приемник, по сигналу которого по точкам строится (частичное) изображение. Диаметр диафрагмы вместе с объективом микроскопа и его числовой апертурой определяет толщину оптического сечения. Толщина изображенного слоя может быть ограничена значениями ниже 1 мкм с очень узкой апертурой и очень хорошими линзами.

Типичные лазерные сканирующие микроскопы представляют собой сложные системы, состоящие из следующих компонентов:

• классический микроскоп;
• один или несколько лазеров;
• сканирующая головка;
• аппаратное и программное обеспечение для управления сбором, оценкой, отображением и архивированием сигналов.

Конечно, это лишь крайне упрощенное перечисление составных частей микроскопа.

Конфокальный сканирующий микроскоп белого света

Если вместо лазера используется белый свет (т.е. свет, состоящий из разных длин волн), также возможны цветные изображения с помощью конфокального микроскопа. Однако белый свет не может быть сфокусирован на объекте с такой высокой интенсивностью, что увеличивает время наблюдения. Вот почему конфокальные сканирующие микроскопы белого света обычно имеют несколько параллельных путей луча, что позволяет одновременно наблюдать несколько точек на объекте.

Благодаря продуманной конструкции, возможно получение изображений в реальном времени. В качестве альтернативы, но более сложной, белый свет также можно получить с помощью импульсного лазера: через фазовую самомодуляцию.

Сканирующая зондовая микроскопия

Это общий термин для всех типов микроскопии, в которых изображение формируется не с помощью оптического или электронно-оптического изображения (линзы, преобразование Фурье световой или электронной волны), а с помощью так называемого Зонда или Сканера.

Поверхность исследуемого образца сканируется по точкам в процессе сканирования с помощью этого зонда, который взаимодействует с образцом. Затем измеренные значения, полученные для каждой отдельной точки, объединяются в одно (в основном цифровое) изображение.

За исключением сканирующей электронной микроскопии, сканирующая зондовая микроскопия основана на соответствующем взаимодействии наноскопического зонда с поверхностью твердого тела. Это взаимодействие может, например, быть на основе механической силы, электрической, магнитной сил или световой волны. Можно и комбинировать эти взаимодействия. Однако термин зонд не всегда следует понимать буквально как материальный объект. В случае со сканирующей электронной микроскопией в качестве Зонда выступает сфокусированный электронный пучок.

Исследуемая поверхность никак не изменяется и не разрушается зондом во время проведения исследования.